Titre: Utilisation des gènes de la lignification pour l'amélioration génétique de la qualité biochimique et technologique du bois en vue d'une utilisation optimale pour la production de pâte et de panneaux.

Ministère de l'Education Nationale de la Recherche et de la Technologie
Direction de la Technologie-DTA2
"Biotechnologies" - F.315
1, rue Descartes - 75231 Paris Cedex
Durée : 3 ans (10/11/98-9/11/2001)
Montant de la subvention : 2 027 000 F TTC

Décision n 98 C 0202, 98 C 0203, 98 C 0104, 98 C 0205, 98 C0206, 98 C 0207

Responsable scientifique

DESCRIPTION DU PROJET

1.

Les industriels français de la filière bois-papier ont à leur disposition une matière première, le bois, dont les caractéristiques chimiques et technologiques ne répondent pas toujours à leurs attentes. A côté des acteurs industriels, des organismes comme l'INRA, L'AFOCEL ou le CIRAD ont entrepris depuis plusieurs dizaines d'années des programmes d'amélioration génétique d'espèces d'arbres forestiers, afin de fournir aux sylviculteurs de la graine améliorée. Si l'objectif affiché de la recherche était et reste encore d'augmenter le rendement en bois, les efforts de la sélection s'orientent aujoud'hui vers d'autres paramètres parmi lesquels la qualité du bois.

Dans la dernière décennie, les progrès de la biologie moléculaire ont mis en évidence la possibilité d'utiliser des techniques de cartographie génétique pour rechercher les régions du génome ou QTL (pour quantitative trait loci) intervenant dans le contrôle génétique de caractères complexes. De nombreux exemples ont mis en évidence de tels QTL chez les plantes de grande culture (Paterson 1995; Paterson et al. 1991), chez les animaux domestiques (Gellin et Chevallet 1994; Anderson et al. 1994), et les animaux de laboratoire (Keightley et al. 1996, Moisan et al. 1996). Nous proposons d'appliquer ces mêmes techniques chez les arbres forestiers dans le cadre d'un projet multidisciplinaire afin d'identifier des zones chromosomiques qui contrôlent la qualité du bois. Parmi les diverses acceptions du terme qualité du bois, nous retiendrons :

- la quantité ainsi que la nature de la lignine, les caractéristiques morphologiques des fibres conditionnant l'efficacité et la rentabilité des process papetiers,

- les propriétés technologiques des fibres et agrégats pour les composites à base de bois (panneaux en particulier).

L'utilisation des zones chromosomiques ou gènes dans le cadre d'un programme de sélection, permettra de choisir (tri moléculaire peu côuteux) dans les collections de génotypes d'élites déjà sélectionnés pour leur vigueur, ceux qui possèdent les formes favorables de ces gènes en vue de la création rapide de variétés à hautes performances papetières et technologiques.

En particulier, nous testerons l'implication des gènes de la chaîne de biosynthèse de la lignine dans le contrôle génétique de caractéristiques biochimiques, technologiques, physiques et papetières du bois. Nos recherches sont prévues sur trois années et afin qu'elles aient une portée générale, elles porteront sur une gymnosperme : le pin maritime, et une angiosperme : l'eucalyptus.

2. Programme détaillé

Nous présentons ici le détail technique des actions de recherches (AR) et des sous-actions (SAR) correspondantes qui seront menées dans le cadre de ce projet. Les partenaires (P) impliqués sont également indiqués. On pourra se référer au tableau 1 pour la répartition des travaux entre les différents partenaires.

AR1: identification de " gènes candidats " et localisation sur une carte génétique

SAR1.1 : établissement de cartes génétiques chez le pin maritime (P4)

Nous avons choisi une descendance de plein-frères appartenant à la troisième génération du programme d'amélioration. Elle compte 200 individus âgés de 13 ans. Les deux parents de cette famille seront cartographiés à l'aide de deux types de marqueurs moléculaires :

- des AFLP (amplified fragment length polymorphism, Voos et al. 1995) qui serviront à saturer rapidement les 2 cartes;

- des RAPD (random amplified polymorphic DNA, Williams et al. 1990) dont on connaît la position sur une carte génétique déjà construite (Plomion et al. 1995)

SAR1.2 : établissement de cartes génétiques chez l'eucalyptus (P2)

Une famille d'hybrides interspécifiques E. grandis x E. urophylla de la deuxième génération du programme d'amélioration mené par le CIRAD a été choisie. Cette famille adulte âgée de trois ans comporte 200 individus dont 93 ont déjà été typés à l'aide de 150 amorces RAPD (Verhaegen et Plomion, 1996). Les deux cartes génétiques des parents ont été réalisées. Dans le cadre de ce projet, 150 individus supplémentaires seront typés avec 50 amorces choisies pour amplifier des marqueurs espacés tous les 15 cM (centi Morgan) environ.

SAR1.3 : clonage de gènes de structure de la voie de biosynthèse de la lignine chez le pin et l'eucalyptus (P3)

Les gènes suivants sont déjà disponibles :

- pour l'eucalyptus : CAD2, COMT sont publiés, CCR, et CAD1 sont non publiés mais ont été récemment séquencés par P3.

- pour le pin : CAD2, PAL, 4CL, COMT sont accessibles dans les banques de biomolécules.

Nous proposons d'essayer d'accéder à la séquence des gènes complémentaires suivants :

- pour l'eucalyptus : PAL, 4CL, C4H, F5H, CCoAOMT

- pour le pin maritime : CCR, C4H, CCoAOMT

(PAL: phénylalanine ammonialyase ; C4H: cinnamate-4-hydroxylase ; COMT: O-méthyl transférase ; F5H: férulate-5-hydroxylase ; CCoAOMT: caffeoyl CoA méthyl transférase ; 4CL: 4-coumarate CoA ligase ; CCR: cinnamoyl CoA réductase ; CAD: alcool cinnamylique deshydrogénase).

Deux alternatives pourront être utilisées pour accéder à ces gènes :

1 - Approche " hétérologue "

Il s'agit du criblage d'une banque d'ADNc à l'aide de sondes hétérologues (gènes déjà séquencés chez d'autres espèces que l'eucalyptus ou le pin). La banque " eucalyptus " est disponible chez P3. La banque " pin " sera réalisée par P4.

Les clones décrits ci-dessous ont été demandés à leur détenteurs, certains sont d'ores et déjà disponibles au laboratoire. Il s'agit de :

• cDNA de la F5H d'Arabidopsis: Arabidopsis thaliana ferulate-5-hydroxylase (FAH1) mRNA, complete cds.

• cDNA de la 4CL d'Arabidopsis: Arabidopsis thaliana 4-coumarate--coenzyme A ligase (4CL) mRNA, complete cds.

• cDNA de la PAL de haricot: cDNA PAL5 Phaseolus vulgaris (bean), fourni par M Dron (Orsay)

• cDNA de CCoAOMT de tabac: fourni par M Legrand (Strasbourg)

naccession: U62735

Martz F, Maury S, Pincon G, Fritig B, Legrand M (1996) Characterisation of four CCoAOMT cDNA in tobacco and analysis of their expression (non publié)

• cDNA de la C4H du peuplier

2 - Approche PCR

Dans le cas où la stratégie de criblage hétérologue s'avérerait infructueuse, on développerait une approche PCR. Une telle approche n'est actuellement envisageable que pour les gènes dont la séquence est disponible chez plusieurs espèces. C'est le cas pour les gènes de la PAL, 4CL, CCoAOMT, et C4H. Un alignement multiple des séquences d'un même gène chez différentes espèces sera réalisé permettant de définir des régions particulièrement conservées, supports pour la synthèse d'amorces nucléotidiques dégénérées utilisées dans des réactions PCR. La matrice sera préférentiellement de l'ADNc (premier brin ADNc ou préparation d'ADN de banque d'ADNc de xylème). La vérification de l'identité des fragments amplifiés sera réalisée par séquençage.

SAR1.4: cartographie de gènes "candidats" chez le pin (P4)

+SAR1.5 : cartographie de gènes "candidats" chez l'eucalyptus (P2)

Il s'agira de choisir des paires d'amorces compatibles (logiciel OLIGO), de mettre au point les conditions d'amplification à l'aide d'un thermocycleur à gradient de température, et de rechercher un polymorphisme dans le gène : soit un polymorphisme de longueur de fragments de restriction de produits PCR (PCR-RLFP) soit un polymorphisme de conformation des simples brins d'ADN amplifiés (SSCP). Le polymorphisme sera recherché dans les zones variables (introns) de ces gènes lorsque l'information (séquence d'un clone génomique chez l'espèce ou un genre proche) existe. La cartographie génétique sera réalisée à l'aide des logiciels MapMaker (Lander et al. 1987) et JoinMap (Stam, 1993). Les gènes qui seront localisés sur les cartes fourniront d'excellents "gènes candidats" pour l'étude du contrôle génétique des caractères quantitatifs étudiés.

Les mesures décrites dans les AR2, 3, 4 et 5 seront réalisées sur les mêmes 200 individus ayant servi à construire les cartes génétiques chez le pin et l'eucalyptus.

AR2 : propriétés biochimiques : la lignine et ses monomères

Nos analyses porteront essentiellement sur la teneur globale en lignine ainsi que sur le dosage des monomères par thioacidolyse (Lapierre et al. 1986).

Une préanalyse sur quelques échantillons de pin visera à comparer deux méthodes d'extraction (toluène ou acétone, P5) et deux méthodes chimiques d'extraction des lignines (Klason et Noll, P1).

SAR2.1 : Taux d'extraits et taux de lignine

SAR2.2 : Dosage des monomères de la lignine chez le pin (200 analyses) (P5)

Les extraits seront fournis par P1.

SAR2.3 : Taux d'extraits et taux de lignine (

+ Etalonnage d'une méthode physique (spectrophotométrie infra-rouge) sur les mêmes 200 échantillons d'eucalyptus (P2)

+ quelques mesures lignin (chimique et physique) sur le billon de pied (P2)

SAR2.4 : Dosage des monomères de la lignine chez l'eucalyptus (200 analyses) (P5)

Cette analyse sera réalisée à partir des extraits obtenus sur le billon prélevé à mi-hauteur commerciale.

AR3 : propriétés papetières (P1)

Récemment, Chantre (1995a, b) montrait qu'il était possible d'améliorer génétiquement la qualité du bois dans un objectif papetier. En effet, sur des clones de peuplier, une variabilité génétique du rendement en pâte kraft et de l'aptitude au blanchiment a été observée. Au niveau biochimique, ces variations ont été mises en relation avec le taux de lignine.

SAR3.1 : propriétés papetières chez le pin (200 analyses) (P1)

+ SAR3.2 : propriétés papetières chez l'eucalyptus (200 analyses

Les caractéristiques papetières seront déterminées dans le cadre d'une mini-cuisson kraft (microtests papetiers). Il s'agit : du rendement en pâte, de la facilité de blanchiment, c'est-à-dire l'indice de délignification (indice kappa), et de la consommation en soude. Les caractéristiques morphologiques des fibres (longueur et largeur des fibres, masse linéique, souplesse) seront également prises en compte. Il s'agira de cuissons Kraft en lessiveurs de 150 ml : rendement en pâte, indice Kappa, alcali effectif résiduel, dans deux conditions de cuisson différentes pour le pin maritime (objectif : Kappa 20 et Kappa 40) et une condition de cuisson pour l'Eucalyptus (objectif Kappa 18)

La morphologie des fibres est mesurée à l'aide de l'appareil PQM 1000.

AR4 : propriétés technologiques

SAR4.1 : microdensitométrie chez le pin (200 analyses) (P4)

SAR4.2 : microdensitométrie chez l'eucalyptus (200 analyses) (P4)

SAR4.3 : mesure de densité au pilodyn chez le pin (200 analyses) (P4)

SAR4.4 : mesure de densité au pilodyn chez l'eucalyptus (200 analyses) (P2)

La plupart des propriétés mécaniques du bois sont assez bien expliquées par la masse de bois par unité de volume ou densité (Zobel et Van Buijtenen 1989, Nepveu 1991). Les propriétés mécaniques du bois comme la rigidité ne sont pas très faciles à mesurer. Par contre, la densité peut être estimée précisément sur des carottes de petite taille dont le prélèvement ne nuit pas à l'arbre. La mesure de la densité sur carotte permet donc d'apprécier indirectement les propriétés mécaniques du bois.

Deux approches seront utilisées afin d'estimer la densité :

- une méthode grossière et indirecte utilisant le pénétromètre ou " Pilodyn " (Sprague et al 1983, Villeneuve et al 1987, Chantre et al 1992). Cet appareil permet de mesurer la profondeur de pénétration dans le bois d'une aiguille propulsée par un ressort étalonné. Cette profondeur est négativement liée à la dureté du bois, elle-même très liée à la densité. Cette méthode reste imprécise car l'information saisie est très localisée et concerne uniquement un point de la périphérie de l'arbre. Cependant, elle est rapide à mettre en oeuvre, peu coûteuse et permet de classer un grand nombre d'arbres sur la densité.

- une méthode directe qui permet de décrire plus finement les variations de densité du bois sur un rayon (du coeur vers l'écorce) : la microdensitométrie (Polge 1966, Parker et Jozsa 1973). Des planchettes fines d'épaisseur constante seront découpées dans chaque carotte puis radiographiées (rayons X ou rayons gamma). Les variations des niveaux de gris sur la radio sont alors liées à la dimension transversale des trachéïdes et donc à la densité de l'empilement des trachéïdes le long du rayon.

SAR4.5 : caractérisation rhéologique de fibres de pin pour des applications en panneaux : mise au point des méthodes sur des échantillons de tailles différentes (P4)

+SAR4.6 : caractérisation rhéologique de fibres de pin pour des applications en panneaux : typage de 200 arbres (P4)

L'OSB (oriented strand board) est un panneau structural réalisé à partir de copeaux rectangulaires orientés dans le sens longitudinal du panneau pour les faces, dans le sens transverse pour le pli intérieur. Cet agencement lui confère des performances mécaniques (rapport rigidité/légèreté) intéressantes. La cohésion de tels panneaux dépend en particulier des caractéristiques mécaniques des particules (souplesse) au moment du pressage du mat.

Le MDF, panneau de fibre à moyenne densité, est un matériau à hautes performances techniques utilisé en ameublement et agencement intérieur. Sa production en France est supérieure à 400.000 m³, pour une capacité de production en Europe de 3Mm³ et de plus de 10Mm³ dans le monde. Si l'adjonction d'une résine synthétique améliore les caractéristiques mécaniques de ce type de panneau, la qualité du MDF dépend avant tout de la qualité des fibres qui le composent.

Ici, l'objectif sera d'étudier l'influence des caractéristiques des fibres sur certaines propriétés importantes de panneaux de grandes particules (OSB) ou de fibres (MDF) : cohésion interne, stabilité dimensionnelle, propriétés élastiques et résistance pour des panneaux porteurs. Cette Action de Recherche vise également des procédés innovants, tels que le cintrage de panneaux plans par thermoformage, en utilisant les propriétés viscoélastiques de la fibre (températures de transition vitreuse des principaux polymères constitutifs). L'essentiel du programme est centré sur les relations fibre (ou copeau) et environnement (température et/ou humidité), qui déterminent l'optimum du processus de fabrication, et la stabilité du panneau mis en oeuvre.

L'étude portera sur l'évaluation de certaines propriétés du bois à une échelle locale qui est celle d'un copeau obtenu par déroulage ou déchiquetage de petits billons. Une phase exploratoire permettra de définir une échelle de mesure acceptable pour ces propriétés. Les billons seront alors échantillonnés dans la famille de pleins-frères, de manière à explorer le maximum de variabilité.

Trois types d'analyse sont prévus :

1) - comportement vis-à-vis de l'humidité

2) - comportement vis-à-vis de la température

3) - fissuration et résistance en traction du copeau 

Dans la phase exploratoire, ces propriétés seront examinées pour différentes dimensions d'échantillons, de manière à déceler un éventuel effet d'échelle qui se superposerait aux propriétés intrinsèques des fibres.

Remarque : La stabilité dimensionnelle sous contrainte de panneaux porteurs à base de lamelles minces, particules ou fibres de bois, pourrait dépendre en partie de deux facteurs : la nature viscoélastique du bois, et les dimensions des éléments. Les interactions mécaniques eau-bois jouent également un rôle déterminant sur le comportement différé des panneaux. Ces aspects sont abordés au travers d'une modélisation micromécanique de tels matériaux. Dans cette modélisation on cherche, par une analyse thermo-mécanique, des marqueurs du comportement viscoélastique du bois (températures de transition vitreuse) en liaison avec sa composition polymérique. Parallèlement des essais de fluage mécanosorptif (i.e. dans un environnement hygrométrique variable) à température ambiante sont réalisés sur des éprouvettes usinées dans des panneaux de fibres (MDF) et de lamelles minces orientées (OSB).

L'étude proposée ici est donc couplée à un travail de modélisation au travers duquel on évalue l'effet du comportement viscoélastique local sur les propriétés macroscopiques.

Pour d'autres applications telles que la mise en forme sous pression de panneaux lors de la fabrication, il est probable que l'effet de la température sur la souplesse des lamelles constitutives jouera un rôle déterminant dans l'énergie mise en jeu dans le process et la cohésion finale du panneau. Pour améliorer la cohérence des SAR4.5 et 4.6 il est proposé que dans la phase exploratoire ces hypothèses soient vérifiées au travers d'une modélisation d'un procédé de mise en forme à une échelle représentative du panneau. Pour ce qui concerne le comportement effectif du panneau, on utilisera les résultats des modèles en cours.

SAR4.7 : caractérisation rhéologique de fibres d'eucalyptus : phase exploratoire (P2)

+SAR4.8 : caractérisation rhéologique de fibres d'eucalyptus : typage de 200 arbres (P2)

En raison de leur importance pour la valorisation en bois d''uvre, 5 propriétés seront mesurées

1)

2) - le module d'élasticité longitudinale

3) - les retraits R, T, L

4) - l'infradensité

5) - la fissilité

En ce qui concerne le protocole, le problème majeur à résoudre est de trouver un compromis entre le nombre, la pertinence des informations recueillies et le coût de l'opération. Afin de rechercher un optimum, deux étapes sont envisagées. Une première étape consistera à prélever parmi les 200 individus du croisement, une dizaine d'arbres représentant toute la plage de variabilité de la famille. En réalisant plusieurs mesures par arbre, on vérifiera la stabilité des corrélations entre le taux de lignine, le rapport S/G, le retrait tangentiel et la DRLM déjà observés sur d'autres hybrides ou individus (Baillères, 1994). Si ces relations s'avèrent stables et suffisamment étroites, elles permettront de minimiser le nombre de paramètres et ainsi réduire le nombre de mesures. La deuxième étape conditionnée par les résultats de la première réside en la mesure systématique d'un nombre limité de caractéristiques sur tous les individus du croisement.

Le plan d'échantillonnage de la première étape se compose d'une dizaine d'arbres, trois niveaux de hauteur auquel on procédera à la mesure de 8 DRLM. Très proches de leur zone de mesure, on procédera aux mesures de retraits et aux analyses chimiques. Dans la deuxième étape, si la première étape donne des résultats acceptables, à une hauteur située à la moitié de la hauteur utile, on prélèvera un billon de 40 cm sur lequel on mesurera le module d'élasticité et l'infradensité sur des barrettes de 12x12x280 mm³ découpées le long d'un diamètre. Sur ces barrettes, les retraits seront mesurés et permettront une évaluation des DRLM et des caractéristiques chimiques (SAR2.3). L'étude des variations de propriétés le long d'un diamètre permettra de définir des caractéristiques de juvénilité. On mesurera la fissilité sur deux éprouvettes par billon, une prélevée en périphérie, l'autre à proximité de la moelle. Les caractéristiques papetières (SAR3.2) seront évaluées à partir de la dilacération d'une rondelle entière découpée dans chaque billon.

Dans le cas où les corrélations entre propriétés ne donneraient pas de résultats satisfaisants, alors une seule mesure par caractéristique et par arbre serait réalisée. L'inconvénient dans ce cas de figure est la perte d'information sur les caractéristiques de juvénilité. Les modules d'élasticité, compte tenu de la rapidité de la mesure, pourraient être évalués selon le même protocole que précédemment. Les caractéristiques chimiques et papetières quant à elles seront évaluées à partir du broyage ou d'une dilacération d'une rondelle entière, afin d'homogénéiser les variations dues au bois juvénile.

AR5 : mesures dendrométriques

SAR5.1 : chez le pin (200 mesures) (P4)

SAR5.2 : chez l'eucalyptus (200 mesures) (P2)

Il s'agira ici de mesurer des caractères cibles de la sélection (croissance en hauteur et diamètre) chez ces deux espèces. Il nous apparaît en effet essentiel de déterminer la nature des relations entre les caractères de la qualité du bois (objet de ce projet) et des caractères de vigueur qui sont actuellement utilisés comme critères de sélection dans les programmes d'amélioration. Notamment des études de modification de la chaîne de biosynthèse de la lignine ont montré que des plants de tabacs transformés pour l'enzyme PAL présentaient un taux de lignine diminué s'accompagnant d'un développement très affecté (Bate et al. 1994). Dès lors que l'amélioration s'adresse à plusieurs caractères il est indispensable de connaître les antagonismes entre les divers critères de sélection afin de prendre en compte cette information.

AR6 : Analyse des corrélations entre caractères de qualité du bois

SAR7.1 : chez le pin (P1, 4, 5), piloté par P4

+SAR7.2 : chez l'eucalyptus (P1, 2, 5), piloté par P2

Nous partons du principe qu'un seul caractère mesuré sur le bois ne suffit sans doute pas à définir ou à décrire la qualité du matériau brut ou du produit transformé au terme d'un process industriel. Par contre, la prise en compte de multiples caractéristiques du bois (propriétés biochimiques, rhéologiques, technologiques, papetières) s'avère a priori nécessaire si l'on souhaite comprendre les mécanismes d'élaboration des propriétés du bois afin de mieux agir tant au niveau de la production de la matière ligneuse (par des méthodes de sylviculture et par la sélection) que de son utilisation. Dans cet objectif de caractérisation globale, les partenaires ayant travaillé sur une même espèce pourront disposer des données qui seront regroupées par P4 dans une base de données internet accessible par mot de passe.

AR7 : détection de QTL

SAR7.1 : chez le pin (P4)

+SAR7.2 : chez l'eucalyptus (P2)

Tous les caractères seront mesurés sur les mêmes individus ayant servi à la construction des cartes génétiques. Dans un premier temps, nous rechercherons des associations statistiques entre le polymorphisme des marqueurs moléculaires et la variation phénotypique de chaque caractère par les techniques de " cartographie par intervalle ". Dans un deuxième temps nous analyserons les situations de colocalisation entre " gènes candidats " et QTL. Ici l'objectif est de montrer l'existence de QTL ou zones chromosomiques qui contrôlent génétiquement les différents paramètres mesurés, pour une utilisation future en sélection. Nous rappelons que la sélection basée sur des marqueurs devrait s'avérer plus efficace et moins coûteuse qu'une sélection phénotypique classique.

AR8 : étude de la variabilité phénotypique de caractéristiques biochimiques et technologiques dans la première population d'amélioration du pin maritime

SAR8.1 : typage de 67 arbres "plus" pour le taux d'extraits, le taux de lignine et microtests Kraft en lessiveurs de 12ml (P1)

+SAR8.2 : typage de 67 arbres "plus" pour la microdensitométrie (P4)

Le pin maritime est utilisé à la fois pour la production de pâte kraft (bois vendu 40 francs le stère, et provenant de produits d'éclaircies, de résidus de scierie, et de la cîme des arbres adultes lors de la coupe rase), et pour la production de bois d''uvre (bois vendu actuellement 130 francs le stère, provenant des billons obtenus lors de la coupe rase). L'étude de la variabilité naturelle de la densité du bois et de son taux de lignine dans la population d'amélioration vise à définir les limites de variation au sein de cette espèce, afin d'envisager une amélioration de la qualité sans qu'elle soit rédibitoire aux critères de productivité chers aux sylviculteurs.

Des études de variabilité menées sur quelques espèces de conifères ont déjà mis en évidence une variation intraspécifique qui pourrait être valablement utilisée dans un programme d'amélioration génétique. Ainsi, 200 arbres de la première population d'amélioration du pin maritime seront sondés (2 carottes par arbre à 1,3m). Le taux de lignine (méthode chimique), ainsi que le profil microdensitométrique seront établis pour chacun de ces arbres.

AR9 : impact technico-économique (P6)

Si les gènes qui interviennent dans la lignification contrôlent une partie de la variation naturelle observée pour la teneur en lignine et/ou pour les résidus monomériques la constituant, il sera possible de sélectionner très efficacement des arbres qui produiront une matière première (le bois) améliorée, facilitant les processus de fabrication de la pâte à papier et d'intérêt pour la réalisation de panneaux. Cette action de recherche vise à chiffrer l'impact économique de ces recherches sur les gains qu'il est possible d'obtenir sur le coût de production de la pâte. Deux paramètres industriels seront analysés. D'une part l'indice de délignification ou indice kappa qui traduit la clarté des pâtes. D'autre part le rendement en pâte (ratio entre la masse de pâte de cellulose et la masse de bois).

L'évaluation technico-économique se fera selon trois scénarios.

Le premier si l'on optimise la composition monomérique de la lignine.

Le second si l'on diminue le taux de lignine.

Le troisième si l'on optimise la morphologie de la fibre de cellulose.

Pour le premier scénario, l'opitimisation de la composition monomérique de la lignine devrait permettre de faciliter l'opération de dissolution de la lignine. Cette opération est indispensable pour obtenir des pâtes possédant les propriétés papetières recherchées. Actuellement, pour obtenir ce niveau de propriétés papetières, il faut dissoudre 75 % de la lignine initiale du bois, or dans cette opération, qui se réalise par action d'agents alcalins (NaOH et Na2S), 35 % des hydrates de carbone sont malheureusement dissous. Une modification de la lignine pourrait permettre une dissolution plus facile de celle-ci, ce qui pourrait alors diminuer la dissolution des hydrates de carbone. Le rendement de transformation du bois en pâte serait alors amélioré.

Pour le second scénario, la diminution de la teneur en lignine du bois devrait permettre d'obtenir de meilleurs rendements. Toutefois, il faudra vérifier que les conditions de délignification connues peuvent s'appliquer de la même façon au végétal modifié, et que la pâte obtenue satisfasse aux besoins.

Pour le troisième scénario, l'optimisation de la morphologie de la fibre devrait permettre de satisfaire les niveaux de propriétés papetières requises avec un taux de lignine résiduaire plus élevé.

Pour valider chacun des scénarios décrits ci-dessus, P6 étudiera différents lots de copeaux contrastés en taux de lignine et/ou en composition en monomères et par la morphologie de la fibre de cellulose (voir tableau ci-dessous).

Pour chacun de ces lots, on procèdera, sur des pilotes de laboratoire, à des essais de délignification. Ces études permettront de mesurer les écarts en terme de rendement, en terme de conditions de cuisson (température et quantité de réactif). Bien entendu, ces écarts seront quantifiés pour des pâtes répondant aux attentes du marché en terme de caractéristiques papetières. Ces études seront complétées par l'analyse des liqueurs après cuisson (détermination du pouvoir calorifique, équilibre de l'unité de régénération). Cette étude permettra, encore une fois pour des pâtes possédant les caractéristiques requises, de déterminer le gain d'énergie éventuel obtenu au cours du raffinage et devra permettre également de chiffrer le gain éventuel de la productivité de la machine à papier (aptitude à l'égouttage, au pressage et au séchage).

3. Conséquences attendues

- Décomposition d'un caractère complexe en composantes élémentaires

L'originalité du projet réside dans une approche pluridisciplinaire de la qualité du bois, qui va de la mesure de caractères biochimiques et physiques à une échelle assez fine, jusqu'à l'étude de leur contribution au niveau de caractères plus complexes comme la densité ou le rendement en pâte Kraft. Il s'agit d'étudier la décomposition d'un caractère complexe en composantes élémentaires, dans le but de comprendre comment s'élabore un produit transformé au terme d'un process industriel.

Au niveau phénotypique, les mesures entreprises étant en relation directe avec la transformation et l'utilisation du bois, nous pourrons déterminer les meilleurs prédicteurs, non seulement au sens statistique mais aussi au niveau du coût de l'analyse, des caractères qui intéressent les industriels.

Au niveau moléculaire, nous cherchons dans ce projet à mettre en évidence des " marqueurs diagnostics " (dont le coût de mise en oeuvre est très faible) pour prédire telle ou telle caractéristique de la qualité du bois.

- Déterminisme génétique des caractères étudiés et corrélation entre caractères

Cette étude doit permettre de déterminer si les caractères de qualité du bois sont sous contrôle oligogénique, c'est-à-dire contrôlés majoritairement par quelques QTL potentiellement manipulables par le sélectionneur. Nous pourrons également voir si ce sont les mêmes zones chromosomiques qui sont impliquées dans le contrôle de caractéristiques biochimiques, technologiques et papetières. Par exemple, chez l'eucalyptus, des résultats récents obtenus par les partenaires n1 et 2, ont montré que si la baisse du taux de lignine entraînait une augmentation du rendement en pâte, elle augmentait aussi les risques d'éclatement des billes de bois (accroissement des DRLM), un inconvénient majeur pour l'utilisation en bois d''uvre. Nous rechercherons dans ce projet si il existe des QTL indépendants pour les caractéristiques favorables à l'utilisation du matériau bois en papeterie (baisse du taux de lignine) et en bois d''uvre (diminution des DRLM). Des QTL indépendants pour des caractéristiques liés mais antagonistes ont déjà été signalés dans la litérature. Il s'agit par exemple de la vigueur et de la densité du bois chez l'eucalyptus ou de la pécocité et du rendement chez le maïs. De tels résultats ouvrent des perspectives quant à l'amélioration conjointe de caractères négativement corrélés.

- Fonction biologique des QTL

Il s'agit de la partie la plus prospective. La détection de QTL résulte purement d'une association statistique entre un polymorphisme moléculaire mis en évidence sur un fragment d'ADN ou une protéine et la variation phénotypique d'un caractère quantitatif. Peu d'études rapportent une relation entre des gènes de fonction connue, intervenant dans des voies biochimiques connues, et des QTL (Causse et al. 1995). L'analyse des colocalisations entre QTL et gènes de la lignification devrait permettre de caractériser des QTL chez ces deux espèces d'arbres forestiers. Nous testerons si les variations phénotypiques observées sur des caractères de qualité du bois sont sous le contrôle des gènes "candidats" comme ceux codants pour les enzymes de la chaîne de biosynthèse de la lignine. L'étude des colocalisations entre gènes de fonctions connues et QTL devrait permettre de mieux cerner les bases moléculaires des caractères étudiés.

- Intérêt général de l'étude

Notre choix de travailler à la fois sur le pin maritime et l'eucalyptus devrait permettre de généraliser nos résultats aux principales essences intéressant la France. Outre l'intérêt énorme pour l'industrie papetière et celle des panneaux, notre approche sur la lignine devrait également bénéficier à la recherche sur les plantes fourragères (maïs, luzerne...) où là aussi une certaine qualité du fourrage est recherchée.

- Intégration de la qualité du bois comme critère de sélection

Le gain génétique en sélection sur un caractère est directement lié à son héritabilité et à sa variabilité phénotypique. D'un point de vue génétique, les caractères de qualité du bois sont généralement plus héritables (moins soumis aux effets du milieu) et moins variables par rapport aux caractères de croissance ou d'adaptation. Dans un projet FAIR (98-2000) financé par l'Europe et complémentaire à celui-ci, les partenaires n1 et 4, s'attacheront à étudier l'héritabilité des caractéristiques biochimiques et papetières du pin maritime.

Tableau 1 : Calendrier des actions de recherches et partenaires impliqués