Trente deux personnes, venant des centres INRA du Moulon, Montpellier, Avignon, Clermont-Ferrand, Versailles, Bordeaux, Lyon (Laboratoire mixte CNRS/INRA/Bayer CropScience), Dijon et de l'INAPG Versailles ont participé à notre réunion annuelle du réseau technologique protéome vert organisée cette année à Dijon.
Participants
M. Zivy, L. Negroni, M. Rossignol, H. Thievellement, V. Méchin, M. le Guilloux, M. Jullien, K. Chibani, M. Faurobert, C Mirch, W. Albertin, G. Branlard, J. Dumur, D. Job, C. Job, L. Rajjou, Y. Lovigny, N. Bahrman, M. Gonneau, J. Burstin, K. Gallardo, R. Thompson, N. Amiour, B. Valot, D. Morandi, G. Recorbet, E. Dumas-Gaudot, D. Hericher, S. Schiltz, F. X. Sauvage, H. Dumazet.
Excusés
D. de Vienne, C. Plomion, N. Sommerer.
Invitée
P. Anglade, invitée en tant que membre du réseau INRA "Protéomes Microbiens" et de sa thématique de recherche portant sur la protéomique des bactéries lactiques.
La réunion a débuté par un rapide tour de table des différents participants à cette journée. En effet, depuis la mise en place de ce réseau, plusieurs groupes/équipes nous ont rejoint et il paraissait utile que chacun puisse à nouveau présenter très brièvement ses intérêts en protéomique et ses besoins à venir en spectrométrie de masse aux plates-formes de protéomique du Moulon et de Montpellier.
Pour mémoire les principales thématiques concernant la protéomique sont listées ci-dessous (pour une description plus détaillée des projets cf. site web), ainsi qu'un bref énoncé des orientations de recherche développées dans l'année écoulée ou en projet de développement.
Réponse à la sécheresse dans les feuilles de mais en fonction de la différenciation cellulaire. M. Zivy : Présentation des différents résultats illustrant les travaux de l'équipe du Moulon.
Étude protéomique des légumineuses (graines de Medicago truncatula et de pois). K. Gallardo : Présentation des 3 thèmes principaux de protéomique (voies de nutrition azotée, remobilisation, morphogenèse et composition des graines) développés au laboratoire de Génétique et Amélioration des plantes (Dijon). Bilan des demandes de MS en 2002 et présentation des besoins en 2003.
Amélioration de la qualité du bois du pin maritime. H. Dumazet : Recherche d'informations sur les protéines impliquées dans la formation et la structure du bois. (Équipe C. Plomion, Pierroton)
Étude protéomique de la qualité du fruit de tomate. M. Faurobert : rappels sur la mise au point d'une carte génétique QTL chez les fruits de tomate, cartographie fine du chromosome 2, la base de données des protéines du fruit au cours de son développement est en voie d'élaboration, perspectives d'une étude différentielle des QTL et du transcriptome.
Approche protéomique de la régulation de l'expression des gènes dupliqués chez les polyploïdes.W. Albertin : Présentation des modèles biologiques d'autoploïdie et d'alloploïdie utilisés. Équipe H. Thiellement, le Moulon.
Approche protéomique pour l'étude de la duplication des gènes de glutinine. N Amiour rappelle ses principaux résultats de thèse obtenus dans l'équipe de G. Branlard (Clermont-Ferrand).
Analyse protéomique des variétés de blés tendres. N. Bahrman : Recherche d'identification de protéines candidates à l'explication des différences variétales pour l'utilisation de l'azote chez le blé tendre. Comparaison de différentes variétés de blés et de 4 doses d'azote (Mons).
Étude de la dormance des graines d'Arabidopsis thaliana et de Nicotiana plumbagina. M. Julien : Explication de la dormance des graines d'A. thaliana et des contenus en ABA.Recherche de protéines différentiellement exprimées entre graines dormantes/non dormantes et de protéines de stress/protection chez les graines dormantes. Recherche des fonctions des différentes protéines identifiées. Paris.
Protéome du mûrissement et de la qualité du raisin. F. X. Sauvage : présentation des résultats obtenus suite à des fractionnements cellulaires (tonoplastes de baies de raisin). Question posée aux participants concernant la non-reproductibilité observée parfois sur les gels (lots IPG???). Montpellier.
Protéomique membranaire d'Arabidopsis thaliana. M. Rossignol : 2 thématiques principales 1) protéines membranaires d'A. thaliana : développements méthodologiques FPLC 2D en micelles et PAGE-SDS : 400 protéines identifiées caractéristiques des membranes (plasmiques, tonoplastiques) et 2) début d'analyse des modifications post-traductionnelles par l'analyse du phophoprotéome (immunodétection des protéines à l'aide d'anticorps anti-protéines phosphorilées détection ECL et couplage à l'or colloïdal). Montpellier.
Protéome de la graine d'Arabidopsis thaliana. L. Rajjou : présentation du site web http://seed.proteome.free.fr et des principaux résultats qui ont permis d'alimenter ce site. (Équipe D. Job, Lyon)
Interactions plantes micro-organismes : analyse protéomique de la symbiose mycorhizienne à arbuscules chez M. truncatula et protéomique d'un champignon MA. E. Dumas-Gaudot : présentation des différentes thématiques développées pour accéder au protéome symbiotique dans la symbiose MA. Rappel des identifications obtenues en 2002 et des insuccès. Estimation des besoins pour 2003.
Institut J.P. Bourgin, INRA Versailles : M. Gonneau a présenté le contexte de sa participation à notre journée : à savoir que les équipes de Versailles sont plus impliquées dans l'étude des métabolites que dans les protéines (et ont déjà accès à des équipements de SM MALDI-TOF et MS-MS sur le site de Versailles), mais pourraient être conduites à solliciter la plate-forme du Moulon.
En l'absence de N. Sommerer, M. Rossignol nous a ensuite présenté le bilan de la plate-forme de protéomique de Montpellier
Rappel des équipements :
IPGphore, Dalt et Ettan Dalt
Analyse d'image : Mélanie 3 et Progenesis
Un spectromètre de masse MALDI-TOF (Bruker, Biflex III) équipé d'une source permettant de traiter des cibles supportant 384 échantillons.
Un robot de dépôt des échantillons sur les cibles (Bruker, MassPrep 2);
Un robot de prélèvement des échantillons (Propic)
Un robot de digestion des échantillons (Multiprobe II);
Un spectromètre de masse à trappe ionique (Bruker, Esquire) équipé d'une source nanospray (le couplage à une HPLC nanobore est demandé dans le cadre de la Génopole);
Un séquenceur de protéines (Porton-Beckman, LF3000) et HPLC microbore pour la séparation des peptides
Le robot de digestion a été parfaitement fonctionnel sur l'année écoulée. Pour les participants intéressés, il est envisagé une augmentation de l'automatisation qui permettra un plus haut débit et l'envoi des échantillons à digérer directement dans des plaques 96 puits (type Elisa) NB : référence des plaques compatibles avec le robot de digestion à demander à N . Sommerer. Après la phase de mise en route des nouveaux équipements de robotique, un abaissement du prix des analyses en MALDI-TOF pourrait être considéré. M. Rossignol rappelle que deux formules de fonctionnement sont envisageables soit une prise en charge complète des échantillons par la plate-forme soit une participation, avec formation à la SM et aux interrogations de données. Cette dernière formule semble plus appropriée pour les équipes demandant des analyses en SM sur des nombres important de protéines.
La plate-forme s'est équipée pour la révélation et la détection des protéines en fluorescence. Visualisation des profils : Système GS 710 FLA 5000 pour la détection en fluorescence.
Le goulot d'étranglement de la S. M. reste l'analyse des données de masse et l'interrogation des bases de données.
La question de la valorisation des résultats de fonctionnement des plates-formes de SM est évoquée par L. Negroni. M. Rossignol répond que selon le type d'investissement réalisé dans le cadre des analyses en SM, il y a soit une facturation au(x) demandeur(s), soit une implication plus importante justifiant une collaboration pouvant conduire à une co-signature d'article(s).
Bilan de la plate-forme de protéomique du Moulon : présenté par Luc Negroni
Rappel des équipements :
Un spectromètre de masse à trappe ionique LCQ Deca (Thermoquest) fonctionnant avec une source nanospray, couplé à partir de décembre 2000 à un système HPLC nanodébit (LC Packing)
Un séquenceur de protéines provenant d'un laboratoire de l'IFR (IBP) et une chaîne HPLC pour la purification des peptides avant séquençage (2001).
Présentation des analyses effectuées sur les 2 années écoulées, et explication des absences de résultats pour certains demandeurs.
La trappe du SM a été changée, la prise en main du nouveau système a pris plus de temps que prévu, mais l'appareil est désormais fonctionnel.
La plate-forme du Moulon s'est équipée récemment :
(1) d'un appareil de digestion automatique des spots (Progest) et L. Negroni nous a précisé les conditions de prélèvement et d'envoi de spots (type de tubes à lui demander etc..) pour rendre, à l'avenir ce service, plus performant.
(2) des systèmes d'analyse d'image 2DE proexpress et progenesis
Le goulot d'étranglement de la S. M. reste aussi le traitement des données (résultats de masse et interrogations des bases de données).
L'après-midi fut consacré à diverses discutions/questions:
1. Analyse d'image et bases de données protéomiques :
Du fonctionnement des plate-formes, il ressort un besoin réel pour stocker les images et les informations issues de la protéomique. Un travail d'expertise a été conduit par H. Dumazet (Bio-informaticienne) à la demande de M. Zivy et C. PLomion. Comme résultat de ces travaux, H. Dumazet nous présente le concept pour la gestion des bases de données de protéomique. Dans un tel schéma, il faut pouvoir retracer les informations sur les plantes, les protéines, les protocoles (extraction, 2-DE...), les données des cartes 2-DE, des cartes massiques etc... Il faut enfin dégager des possibilités de modélisation (relation d'allélisme...). Les étapes parcourues ont été les suivantes :
Créer un schéma de concept
Créer un programme informatique pour charger les données
Inclure une étape permettant d'interroger la banque de données ainsi générée (nécessité de conserver un historique sur les spots)
Intégrer des données d'expression (l'idée est d'obtenir des profils d'expression en fonction des protéines étudiées)
Il s'avère que les insertions par lots de données sont possibles mais nécessitent une vérification sur la cohérence des données avant que celles-ci puissent être envoyées par e-mail à l'utilisateur.
Il apparaît la nécessité d'une interface de chargement pour obtenir également des informations de la plante au gel 2-DE
La question se pose alors du modèle de chargement : Image de gel/type de prélèvement/plante
L'insertion doit être interactive avec des sous division plante/variété/ cultivar
L'archivage des données : l'idée est ici de concevoir les possibilités de stockage à l'adresse où se trouvent les données originales. Cela doit être un outil de gestion (ex : pour un peptide donné on doit pouvoir retourner à l'adresse des fichiers et retrouver les données inter expériences).
Conclusion et perspectives :
Inclure la comparaison de l'expression des gènes : inclure des outils de comparaison transcripts/protéines.
Cette base de données est destinée à être exportée à la demande des utilisateurs.
H. Dumazet propose aux personnes intéressées de reprendre contact avec elle via le réseau quand le système d'archivage sera finalisé.
2. Discussion sur un projet d'équipement commun d'analyse d'image avec des systèmes de sous-licences
L'analyse d'image (gels) est une étape clef de la protéomique, mais elle est encore, malgré l'existence de différents logiciels d'analyse d'images (Master 2DElite; Melanie), fastidieuse et très longue, C'est pourquoi la question d'une possibilité d'acquisition d'une station de travail (workstation) avec des achats de sous licences (licence editor) a été envisagée au sein du réseau.
M. Zivy nous informe que la plate-forme du Moulon vient de s'équiper du système PROGENESIS (82000 EU) pour l'analyse d'image et nous fait une présentation rapide des caractéristiques de ce système et de son intérêt.
Rapidité d'exécution,
Fiabilité et sensibilité de la détection des spots,
Fiabilité et rapidité de l'appariement des spots (matching),
Fiabilité de la quantification,
Fourniture de statistiques de détection etc…
M. Zivy nous informe des différentes possibilités : achat d'une licence type workstation (prix négocié à 80000EUs/5O000 à Montpellier!!). Ensuite le coût de la première licence serait de 9000 EU et de 5000 EU pour les licences suivantes.
La question reste en suspens : il est proposé que les demandeurs d'analyse d'image en grand nombre intéressés par Progenesis contactent les différentes sociétés distribuant ce logiciel afin de s'informer des réelles possibilités d'achat de sous licences sachant que la négociation ne peut être qu'à posteriori puisque les 2 plates-formes se sont déjà équipées des "workstation".
3. Divers
Question de G. Branlard concernant les interrogations des bases de données. Luc Negroni répond en présentant les critères (et leur classement) utilisés pour accepter ou rejeter une interrogation de base de données à l'issue d'une analyse de MS
CAS DU MODE MS
Nombre de peptides de digestion qui ont permis d'obtenir une bonne masse (il est souhaitable d'avoir le plus grand nombre possible de peptides qui matchent avec les peptides issus des bases de données (digestions théoriques)
Examen du rapport m/z
% de couverture de la protéine et distribution des peptides sur la protéine
Examen de l'écart de masse de chacun des pics qui ont servi à l'identification
Nombre de clivages ratés (mismatch) (ex pour la trypsine après lysine arginine)
Examen des conditions de fonctionnement du spectromètre
Ne mettre les modifications optionnelles (phosphorilation etc…) qu'en deuxième temps afin de ne pas trop restreindre la recherche
CAS DU MODE MS-MS
Explication du principe du fonctionnement en MS-MS et du dépouillement d'un spectre.
Avec 2 peptides dont on a le spectre MS-MS on peut arriver à identifier une protéine
Il faut aussi faire des corrélations entre le code barre (spectre MS-MS) de la protéine et d'autres paramètres statistiques tels que le Xcorre etc..
Exemple une couverture de 10% de séquences mais avec 5 spectres MS-MS appartenant à des peptides différents donne une bonne fiabilité à l'identification
Donc en MS-MS le critère suffisant est qu'il y ait au moins 2 spectres MS-MS
La possibilité de séquençage de novo en MS-MS en trappe d'ions est toujours difficile voir impossible du fait d'un manque de fragments et des importantes possibilités d'erreurs. Le séquençage de novo reste donc encore très problématique en MS-MS en trappe d'ions.
4. Présentation de la demande dijonnaise de création d'un atelier de protéomique Présentation par E. Dumas-Gaudot
Historique et contexte dijonnais
Présentation brève du projet soumis à la commission d'audit de l'INRA
Plan de financement
5. Discussion rapide sur la technique ICAT à la demande de K. Gallardo
6. Question de G. Branlard sur les protéines de réserve c'est-à-dire des protéines pauvres en lysine et arginine et donc très difficilement (voir impossible !) digerable par la trypsine (qui est la plus employée en préalable à la SM). La suggestion des participants est d'essayer la protéase V8 qui est connue pour bien digérer les protéines de réserve.
La proposition de G. Branlard d'organiser la prochaine réunion du réseau PV à l'INRA de Clermont-ferrand est acceptée à l'unanimité par les participants. La réunion est close à 17h.
Note de l'auteur !!
C'est vrai que dans ce compte -rendu il manque ce qui intéresse le plus les 2 plates-formes, à savoir le nombre d'analyses que nous leur donnerons à faire en 2003 mais … , l'ensemble des participants n'ayant pas fait figurer leurs demandes il m'était difficile de le faire….
Protéomiquement vôtre,
Eliane